新学期がまたやってきたじっけんわんまた「煉瓦運び」に行きます
どう優雅なタイル運びまだ助けを求めなくても兄弟子の先輩.

もちろん注目「奥ちゃん教室」欄ああ

今日は奥さんが紹介してくれた
は1篇です干物がいっぱいの
ファージ展示方法実践マニュアル
「ファージの増幅と定量」

せっかく勉強ができた人のノートです
しまってください！

パート1

ハイブリドーマ、単細胞クローン和ファージディスプレイ技術抗体発見の3つの主流技術であり、その中でファージディスプレイ技術としてノーベル賞クラスの技術生物革新医薬の研究開発過程において非常に重要な役割を果たしており、*抗体系薬物の開発を加速させた。ファージディスプレイ技術新しい抗体とポリペプチドの発見と最適化の過程で核心的な役割を持つだけでなく、伝統的な動物免疫技術と結合し、ナノ抗体、全ヒト源遺伝子組み換えマウスの発見プラットフォームと効果的にドッキングすることができ、抗体、抗体カップリング薬、CAR-T/TCR-Tなどの分野で広く使用できる。本文はファージ展示技術のファージ増殖と増幅実験の詳細について検討し、具体的な実験過程の経験を共有し、その原理を根本として実験過程を指導し、精進する実験過程を用い、ファージ展示技術の抗体発見過程における成功率を増加する。

パート2

――ファージライブラリー
増幅と展示の基本原理｜

現在一般的に用いられているファージが抗体断片を示す系を「3+3システム」（3はファージのp 3カプシド蛋白質）；3+3p 3カプシドタンパク質には2つの源があることを示しています：

• ファージ（phagemid）
• M 13 KO 7補助ファージ（Helper Phage）

菌粒（phagemid）上のp 3タンパク質は抗体断片の遺伝子を融合させ、ライブラリーの多様性の鍵である。ほじょバクテリオファージ（Helper Phage）上のp 3タンパク質はファージ天然のp 3タンパク質である。
*ファージは比較的小さなプラスミドベクターであり、大腸菌受容状態において高い転化効率があり、大腸菌中で増幅することができる。

バクテリオファージを含む大腸菌は補助バクテリオファージ（Helper Phage）に感染すると、大腸菌の酵素系、原料、エネルギーを利用して増幅され、最終的にバクテリオファージを含むバクテリオファージは大腸菌から放出され、この子バクテリオファージのp 3カプシドタンパク質は抗体断片を示す。

パート3

――ファージ増幅過程において
直面する課題と対応するソリューション｜

ファージのバンク形成過程は実際には抗体断片遺伝子の多様性の伝達過程である：
血液サンプル中の抗体遺伝子の多様性からバクテリオファージに伝達する過程は、バクテリオファージライブラリー構築の内容であり、
バクテリオファージの多様性からバクテリオファージを含む大腸菌に伝達される多様性は、バクテリオファージプラスミド電転大腸菌の内容である、
ファージを含む大腸菌の多様性からファージの多様性に伝達することはファージ増幅の内容であり、本文の実験経験の注目すべき問題でもある。

ファージの増幅の最終目的は、ファージの増幅過程を通じてファージ中の単一コピーの抗体断片遺伝子を10-100コピーにすることであり、そして、これらのコピー遺伝子はファージ表面のp 3タンパク質上に抗体タンパク質断片を示すことができる。

バクテリオファージの増幅過程においてライブラリーの多様性を維持し、伝達するには、ライブラリーの初期サイズに基づいて、増幅過程にバクテリオファージを含む大腸菌の数と体積を決定し、添加した補助バクテリオファージの数に応じて有効な感染を行う必要があり、増幅後にバクテリオファージを含むバクテリオファージをどれだけ添加して選択するかなど、一つ一つ計算評価する必要がある問題、ライブラリサイズの異なるファージライブラリでは、増幅中に必要な増幅体積が異なります。硬化した実験案は、ライブラリーの多様性を失う可能性が高い。
これらの問題を明らかにするには、まず次のような基礎的な事前知識が必要です。

（👇以下の内容はすべてポイントを引く！！！）

1. OD 600におけるTG 1大腸菌の示度：1 ODに代表される菌濃度は1 e 9個／mlである。
2. ファージ/補助ファージはTG 1が対数生*にある時に比較的に良い感染効率があり、TG 1が対数生*にあるOD 600値は0.4-0.8である。
3. TG 1の対数生*での成長速度は20分世代であり、TG 1の成長に密接に関心を持ち、直ちに菌を採取して実験を行う必要がある。4. 補助ファージとTG 1の比MOIは、20：1ですべてのTG 1が感染することを保証することができる。
5. ファージを含むファージは正常なTG 1大腸菌に感染し、ファージをTG 1に残し、TG 1の増幅に伴って増幅することができ、補助ファージがない場合はファージの増幅がない。
6.ファージ粒子プラスミドは*耐性を含み、補助ファージは*耐性を含む。
7. ファージ粒子を含むファージは、正常なTG 1に感染し、勾配希釈コーティング*耐性の寒天板によって滴下測定することができる。8.3+3モードでバクテリオファージを含むバクテリオファージはp 3融合抗体フラグメント蛋白質の効率が比較的に低く、5%-10%しかないことを示しており、研磨を行う際、添加したバクテリオファージの滴下率はライブラリーの多様性の100倍以上であるべきである。
もう一つ重要な問題はファージはウイルスとして、エアロゾルの形で空気中の汚染実験室の環境に拡散しやすく、F因子陽性の大腸菌に感染する。（バイオワンをかわいがって、命の危険を冒してレンガを運びましょう！）
にファージディスプレイに関する実験比較的閉鎖的な実験室で行う必要があります大腸菌に対するファージの汚染を避けるために、特に正常なTG 1大腸菌を培養する場合。ファージの不活性化方式は通常、紫外線照射が30分以上である。
（合格したバイオワンは、感情を得られないウイルスキラーだ！）

パート4

――ファージ拡散ぞうかていりょう
具体的な実験過程の共有｜

以下は1 E 9サイズのライブラリーを用いたファージライブラリーの増幅実験案である。
*ライブラリーが大きすぎるか小さすぎる場合は、増幅体積を比例して増減することができます。

1日目
（れんがのハゲを運ぶ日）

1. バクテリオファージを含むTG 1菌種1 ml（菌数1 E 10）を100 ml 2 xYT-GA培地を含む250 mlフラスコに加え、使用するオーハウスロッカ37度220 rpmロッカからOD 600までは約0.5。2. OD 600が約0.5の菌液20 ml（菌数1 E 10）をとり、MOIが20：1でpfuが2 E 11の補助ファージM 13 K 07を加え、37度220 rpmで30分間振動して感染した。3. 感染後の菌液を50 ml遠心管に採取して使用するオーハウス遠心機5816 R3200 gを10分間遠心分離バクテリオファージ中のp 3タンパク質に対する培地中のグルコースの融合抗体フラグメントタンパク質発現の抑制を除去するために培地を除去する。4. 2 xYT−AK培地を用いて菌団を再懸濁し、培地を400 mlに加え、1 Lフラスコを用いて30度220 rpmで一晩菌を振った。

2日目
（レンガのハゲを運んだ翌日）

5.400 mlの菌液を大きな遠心フラスコに均等に分け、使用するオーハウス遠心機5816 R 10000 g遠心10分間、上清を取り、10000 gを再び10分間遠心分離し、残った菌体の破片を除去する。6. PEG溶液90 mlを上清400 mlに添加し、4℃で1時間インキュベートし、穏やかな振動を伴った後、低温制御機能付きのオーハウス遠心機5816 R 4℃10000 g遠心1時間。7. 上清を除去し、10 mlのPBSでファージを再懸濁後、PEG溶液2.5 mlを加えて再度沈殿.8. 氷の上で20分間インキュベートし、その後低温制御機能付きのオーハウス遠心機5816 R4℃10000 g遠心半時間。9. 上澄み液を除去し、残留PEG溶液を吸水紙で吸引乾燥し、PBS重懸濁ファージ1−2 mlを加えて滴下測定を行った。

滴下測定：
1. 分離した実験室で、正常なTG 1大腸菌を2 xYTの培地に添加し、使用するオーハウスロッカOD 600値が0.5になるまで菌を振る時間通りに使用できなかった場合は、4℃に2時間入れて予備に使用することができます。
2.ステップ9で増殖したファージ原液をPBSで1 E 5−1 E 7倍希釈した。
3. 10 ulファージ希釈液を490 ul OD 600を0.5としたTG 1大腸菌に加え、使用するオーハウスロッカ 37℃220 rpmで半時間振動感染を行う。
4. 感染液50 ulを2 xYT−GAを含む寒天板に均一に塗布し、乾燥後37℃の培養箱に一晩入れた。そして、未感染TG 1大腸菌を寒天板に塗布して陰性対照とした。

3日目
（レンガのハゲを運んだ3日目）

5. 2 xYT-GAの寒天板中のクローン数を数え、希釈倍数から増幅ファージの滴下度を計算する
ファージ滴下（pfu/ml）=（クローン数*10*50/10 ul）*希釈倍数
6.1 E 11-1 E 12のファージを採取して選択に用いた。

試薬処方：
2 xYT培地：酵母抽出物10.0 g/L+トリプシンペプトン16.0 g/L+塩化ナトリウム5.0 g/L
2 xYT−GA培地：2 xYT培地+100μg/ml*+1%（W/V）グルコース
2 xYT−AK培地：2 xYT培地+100μg/ml*+50μg/ml*
PEG溶液：20%（w/v）ポリエチレングリコール6000、2.5 M塩化ナトリウム

パート5
計器*：

（科学研究の出稼ぎ労働者の毎日は寂しくない、奥さんがいるから）

ファージはウイルスとしてエアロゾルの形で空気中に拡散しやすく、実験室の環境を汚染し、閉鎖された実験室が必要で、実験室のすべての機器は単独で使用する必要がある。
オーハウス恒温軽負荷培養ロッカ回転速度範囲は100-12-rpmで、体積が集約され、機能が強く、サンプルに優れた揺れ効果を提供することができます：

また、ファージ展示実験の過程で異なる体積、異なる回転速度、4℃条件を必要とする遠心工程があり、もし以多
テーブル遠心分離機実験の需要を満たす実験設備の資産が空っぽになり、*の浪費になる！！！

オーハウス5816 R多機能遠心分離機及び選択可能な回転子はファージ関連実験に便利を提供し、1台の遠心機はすべての実験需要を満たす！

次に、奥さんが案内してくれます
「科学研究費を節約してあげる」という車
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ドイツ*
強力で遠心分離効果に優れた
オーハウスフロンティア™遠心分離機ファミリー
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*モデルは次のとおりです。
微量高速遠心分離機FC5515R（冷凍タイプ）
微量高速遠心分離機FC5515（非冷凍タイプ）
新小型マイクロ遠心分離機FC5513
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