前回の小奥の授業でみんなに話しました『ELISA方法学開発実践版-生体高分子検出の定量方法開発』。
今回、奥さんはもう一つの重要な話題を共有します：『ELISA方法学開発実践版-親和性測定方法開発』。

一、はじめに

現在、受容体リガンド間の親和性、すなわち解離平衡定数を測定するための方法は、主に：

1. 熱力学測定方法
2. 動力学測定方法
3. ほうわのうどほう

その中で動力学測定方法と飽和濃度法は比較的に通用する：動力学測定方法（Biacoreなど）比較的高価な機器投入に関連して、飽和濃度測定法は国内のほとんどのバイオ医薬品企業が常用する測定方法である。

ELISAの親和性の測定は飽和濃度測定法の主流モデルであり、抗原タンパク質または抗体のタンパク質レベルの活性評価や抗体の安定性評価などによく用いられる。
ELISAは親和性測定のために商業化されていないことが多く、実験者による方法学的開発が必要である。

生物技術という面での教育不足と新薬開発企業のここでの応用の蓄積が不足しているため、方法学的に検証できるELISA親和性測定方法は多くの従業員にとって難しいことであり、新号伝達ミスや偏差などの誤謬が発生する可能性が高い。
その中の1つの誤用はELISA定量の実験条件を用いてELISA親和力測定方法の開発を行うことである。

本文は親和力の測定方法の基本原理から着手する飽和濃度法による親和力測定の基本原則を述べ、ELISA方法の開発過程における抗原抗体の用量関係及びELISAが親和力測定方法の応用に用いられる際に発生する可能性のあるいくつかの誤りを概説し、共通の親和力測定の方法と初歩的な方法学開発の方案を紹介する。

二、親和性基本概念

いくつかの化学反応例を分析して、親和性とは何かを説明します。

例子A
水素と酸素は点火条件下で水を生成する。
反応停止時、反応環境中の水素ガスのモル濃度が酸素ガスのモル濃度のちょうど2倍であれば、両者とも消費され、反応環境中に水しかない、水素ガスのモル濃度が酸素ガスのモル濃度の2倍より大きい場合、酸素が消費され、反応環境には水素ガスと水しかない、水素ガスのモル濃度が酸素ガスのモル濃度の2倍未満の場合、水素ガスは消費され、反応環境には酸素と水しかない。
これは化学反応に関する基礎知識であり、化学反応が進行した結果、反応物が生成物に変化することができ、すなわち反応が最後まで進行することができ、このような反応の過程と結果特性を持つ反応を不可逆反応と呼ぶ。

例子B
PD 1抗原（CD279）PD 1抗体（peなど）mbrizumab）常温常圧で反応する。
反応停止時に、反応環境中のCD 279のモル濃度が200 nM、pembrolizumabのモル濃度が100 nMである場合、理想的な条件下でのpembrolizumab-CD 279複合体の濃度は97.86 nM、CD 279のモル濃度は4.28 nM、pembrolizumabは2.14 nM、
反応環境におけるCD 279のモル濃度が100 nM、pembrolizumabのモル濃度が200 nMである場合、理想的な条件下におけるpembrolizumab−CD 279複合体の濃度は49.81 nM、CD 279のモル濃度は0.38 nM、pembrolizumabは159.19 nMである。

例C
PD 1抗原（CD279）及びPDL 1抗原（CD274）常温常圧で反応する。
反応環境におけるCD 279のモル濃度が200 nM、CD 274のモル濃度が100 nMの場合、反応完了時の理想条件におけるCD 274-CD 279複合体の濃度は2.35 nM、CD 279のモル濃度は197.65 nM、CD 274のモル濃度は97.65 nM、
反応環境におけるCD 279のモル濃度が100 nM、CD 274のモル濃度が200 nMの場合、反応完了時の理想条件におけるCD 274-CD 279複合体の濃度は2.35 nM、CD 279のモル濃度は97.65 nM、CD 274のモル濃度は197.65 nMであり、ほとんどのCD 279とCD 274は反応に関与していない。
ケースB、Cの2つの場合、抗原と抗体にかかわらず（リガンドと受容体）結合反応、両者の反応には複合体を生成する正反応過程があり、複合体解離反応による抗原生成、抗体逆反応過程もあり、最終的な結果は抗原、抗体と抗原-抗体複合体の3者が共存している状態である。

このような反応をかぎゃくはんのう。
1つの可逆反応における正反応と逆反応の速度が等しい場合、反応系における抗原の濃度、抗体の濃度と抗原−抗体複合体の濃度はもはや増加も減少もせず、可逆反応は完了し、反応系における各成分モル濃度は動的平衡にある。

しんわりょく（親和性）は可逆反応過程における抗原、抗体と抗原-抗体複合体間の相対状態の特徴パラメータであり、そのより専門性と用語化の名称は解離平衡定数KD、単位mol/L（濃度単位と一致）。

親和力の数値が小さいほど親和力が強くなり、親和力の強弱は最終決定反応が完了したときの可逆反応の各成分の相対的な多さを決定した。

例B及びCと同様に200 nM CD 279（PD1）反応、抗体pembrolizumab（PD 1抗体）CD 279に対する親和性は0.4 nMであり、リガンドCD 274（PDL1）CD 279の親和性が8200 nMであるのに対し、最終反応で生成されたpembrolizumab-CD 279複合体は97.86 nMであり、CD 274-CD 279複合体はわずか2.35 nMであり、両者の差は42倍であった。

不可逆反応とは異なり、抗原抗体のモル濃度のほか、抗原と抗体（リガンドと受容体）両者の間の親和性は*の影響を可逆反応における生成物の数に影響する。

三、ELISAが方法学開発を行う際の基本原則を知っていますか。

親和力測定方法と原理の概要については、読者は生物機能学スクリーニング評価技術の親和力評価編を参考にすることができる。
本文は主に飽和濃度法について概括する。
R代表じゅようたいまたは抗原，L代表リガンドまたは抗体。
飽和濃度法を用いて、受容体に対する配位子の親和性を測定する場合、少量のRが存在する場合、Lを勾配希釈し、R−L複合体の濃度を検出し、R−L複合体の濃度が全R濃度の半分を占める場合、Lに対応する濃度値（EC50）すなわち、Rに対するLのKD値である。
RL複合体／RすなわちB値は検出された信号値に置き換えられ、勾配希釈されたLと信号との関数関係は以下の式を満たし、ここで特定の実験条件下でのみEC 50値はKD値と等価であることができる。
飽和濃度法によるKD値の測定にはいくつかのポイントがあり、すなわち相互作用する2分子は、Rは少量、Lは連続的な勾配希釈を行うには、得られる信号応答値（すべてのRの結合部位はLに占有される）すなわちプラットフォーム期間であれば、この条件下でRの半分を占めたときに必要なL濃度（EC50）はKD値です。
飽和濃度法は主にRL複合体を代表する信号値を測定し、測定方法はフローサイトメトリー、同位体標識法、蛍光偏光であってもよく、ELISAであってもよい。

四、親和力測定のためのELISA方法学開発常用方法

レイアウト

一般的な操作フロー

01酵素スケールプレートの製造：濃度100 ug/ml抗原を採取し、室温で溶解し、混合用被覆液を以下の手順で0.2 ug/ml、0.5 ug/ml、1 ug/mlに希釈し、サンプルレイアウト表に従って100 ul/ウェルを添加し、それぞれ酵素スケールプレートに添加する（注1）、その中に被包液を添加して被包抗体の対照とし、2 ~ 8℃で一晩;
02洗浄液で板を3回洗い、乾燥させ、300 ul/穴閉鎖液を加える（注2）室温で1時間閉鎖する、洗浄液は板を3回洗い、乾燥させて使用する;
03配列に従って抗体を100000 ng/mlから3倍の勾配で希釈する（注3）、レイアウトに応じて、100 ul/穴が微孔板に追加されます。
04入れるオーハウスマイクロプレート発振器 （ldmphdgです）内、37℃、600 rpm振動を1時間設定する、

05洗濯液で板を3回洗い、たたいて乾かす、
06酵素結合抗体を適切な濃度に希釈する（注4）、オーハウス渦計（VXMNFS）上混合、100 ul/穴、

07微孔板発振器内に入れ、37℃、600 rpm発振を1時間設置する。
08洗濯液で板を4回洗い、たたいて乾かす、
09酵素結合抗体に対応する発色液を採取し、使用20分前に室温まで平衡を取り、渦巻混合器上で混合する、
108本のガンを使用して100 ul/ウェルで発色液を添加する、
11発色液室温遮光10-30分放置（注5）；
128本のガンを用いて100 ul/ウェルで終止液を添加して反応を停止した（基質によってはこの手順は必要ない場合があります）；
13酵素スケールで信号値を測定する（注6）；
14結果の分析（注7）。

心配りの小さなNOTE

注1：反応過程で高濃度の抗体を減らす必要があれば（10万g/ml）酵素標準板材の非特異吸着に対して、被覆過程において、疎水性酵素標準板材の選択を提案する（ポリスチレン）被覆の抗原濃度は少量の0.2〜1 ug／mlを必要とし、具体的には抗原抗体の親和性の大きさに基づいて判断最適化を行う必要がある。一般に親和性が強いほど、必要な抗原被覆濃度は低くなる。
注2：閉鎖液は必ずしも閉鎖効果を発揮できるとは限らず、実験検証が必要である（未被覆抗原のグループ化）、一般的に分子量の小さい封止剤ほど効果が高い。
注3：方法学開発の初期には標準曲線の濃度範囲100000 ng/ml-0.1 ng/mlを大きくすることができ、抗原抗体間の親和性が強い場合には勾配濃度を縮小することができ、希釈の倍数は方法学最適化の過程で2倍に縮小することができる。
注4：酵素結合抗体効果が過剰であり、酵素結合抗体の希釈は異なる希釈度で比較選択する必要があり、単抗成分の酵素結合抗体に対して、高低2つの希釈度の酵素結合抗体が同じ用量曲線を生成することができれば、酵素結合抗体が過剰であり、ELISAの信号伝達にばらつきが生じていないことを説明する。
多抗成分の酵素結合抗体については、その希釈度の判断が複雑であり、酵素結合抗体のモル濃度は被覆上の抗原モル濃度の5倍以上であることを初略計算することができる。酵素結合抗体濃度が比較的小さい場合、酵素結合抗体は高用量の異なる濃度の抗体条件下ですべて捕捉され、曲線に偽上プラットフォームがある。
注5：吸光度値基質と蛍光基質については、機器検出の信号値と発色時間は比例し、10〜30分に制御するのが望ましい。一般的な酵素スケール吸光度値の信号線形範囲が0-3、吸光度値が3-4の間で非線形であり、発色時に信号値を3を超えないように制御すべきであり、信号値が線形範囲を超えた場合、曲線に偽のプラットフォームがある。
注6：異なる基質は異なる機器を用いて検査、吸光度読み取り値、蛍光読み取り値、化学発光読み取り値を行う必要がある。基質選択中に実験室の酵素スケールがこのタイプの示度機能を備えているかどうかに注意する。
注7：標準的な線量曲線フィッティングは一般的に4パラメータでフィッティングされ、明らかな上下プラットフォーム期が必要である（A，D値）、傾斜は一般的に0.8-1.2（B値）の間に、EC50（C値）すなわち抗原に対する抗体の親和性の値である。

五、まとめ

飽和濃度法によると、ELISAを用いて親和力測定を行う際には、抗体濃度に応じて漸進的に変化する信号曲線を必要とする明らかな4パラメータS型曲線が必要である。
抗体低濃度と高濃度の時に明らかな上下プラットフォーム期があり、上平期信号値の半分が対応する抗体濃度（EC50）値、すなわち抗原抗体間親和性KD値である。
計器の検出信号の線形範囲は限られているため、信号が線形範囲を超えると曲線が擬上プラットフォーム期に入り、測定された親和性が不正確になる。
被覆の抗原濃度は信号の信号値を直接決定し、したがって、ELISAを用いた親和性測定の際には、適切な信号値を得るために、被覆抗原濃度はできるだけ小さくしなければならない。酵素結合抗体濃度が低すぎると、曲線が偽プラットフォーム期に入る可能性もある。

ELISA方法学の開発過程では、酵素結合抗体の過剰な信号の線形伝達は実験的に検証される必要がある。
信号が有効なアッププラットフォーム期間を得ることができない場合、抗原抗体間の親和性が弱いか、抗原に包まれすぎていることを示し、すべての抗原がプラットフォーム期間を達成するために捕捉されるには、より高濃度の抗体が必要である。
ELISAの感度に制限され、親和性が弱いものもあります（>100nM）の抗体抗原のうち、ELISA法を用いては有効なプラットフォーム期間がほとんど得られず、測定することもできない親和性数値が得られた。
ELISAが親和力測定を行って抗原の活性を評価したり、抗体活性を測定したりする場合、得られるEC 50は小さいほど良いわけではなく、信号は偽プラットフォーム期に入る（機器の検出限界に達し、酵素結合濃度が小さい）いずれもEC 50を小さくし、誤った親和性データを得ることになるが、これもELISAが親和性測定を行う際に生じやすい誤謬である。
現在、多くの抗原タンパク質の供給業者による抗原活性の評価にはこのような誤謬が存在している。

抗原と抗体間の親和性は両者の構造と相互作用によって決定され、0.1 nM、1 nMまたは1000 nMである可能性がある。ELISA親和力測定方法の善し悪しを評価するには、このEC 50値が親和力の値と一致するかどうかを見る必要があり、親和力の値は熱力学測定方法、動力学測定方法、飽和濃度法における細胞流式測定法などにより多方面に検証することができる。
逆に言えば、ELISA方法に信号が偽プラットフォーム期間に入るなどの信号が存在しない場合（機器の検出限界に達し、酵素結合濃度が小さい）誤謬を待ってこそ、そのEC 50値は真の反応親和力の値になる。

ELISAを用いた方法学の開発には、応用目的を明確にし、高分子定量と親和力測定が必要である。
異なる応用目的により、抗原と抗体の相対用量濃度は大きく異なり、異なる用量曲線があり、読者は前編「ELISA方法学開発実践版-生物高分子検出の定量方法開発」と結合して比較研究を行い、明確な違いを明らかにすることができる。

今号のシェアはここまでです。また次回会いましょう！

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